지난 번 올림픽 교실에서 모두에게 이야기했다"ELISA 방법학 개발 실천판-생물대분자 검출을 위한 정량적 방법 개발"。
이번 소오는 또 다른 중요한 화제인'ELISA 방법학 개발 실천판-친화력 측정 방법 개발'을 공유한다.

1. 머리말

현재 수체 배체 간의 친화력, 즉 해리 균형 상수를 측정하는 데 사용되는 방법은 주로 다음과 같습니다.

1. 열역학 측정 방법
2. 동력학 측정 방법
3. 포화농도법

그중 동력학측정방법과 포화농도법은 비교적 통용된다.동력학 측정 방법(예: Biacore)비교적 비싼 기기 투입과 관련되어포화 농도 측정법은 국내 대부분의 생물 약물 기업이 자주 사용하는 측정 방법이다.

ELISA가 친화력 측정에 사용하는 것은 포화농도 측정법의 주류 모델로, 항원 단백질이나 항체의 단백질 수준에 대한 활성 평가와 항체의 안정성 평가 등에 많이 사용된다.
ELISA는 친화력 측정을 위해 상용화된 시약함이 없는 경우가 많아 실험자의 방법학적 개발이 필요하다.

바이오기술이라는 방면의 교육 부재와 신약 연구개발 기업이 여기에 응용할 수 있는 축적이 부족하기 때문에, 방법학적으로 검증할 수 있는 ELISA 친화력 측정 방법은 많은 종사자들에게 비교적 어려운 일이며, 신호 전달 오류나 편차 등 오류가 발생할 가능성이 높다.
그 오류 중 하나는 ELISA 정량의 실험 조건을 채택하여 ELISA 친화력 측정 방법을 개발하는 것이다.

본문 은 친화력 측정 방법 의 기본 원리 에서 착안 하였다포화농도법 친화력 측정의 기본 원칙을 설명하고, ELISA 방법 개발 과정에서의 항원 항체의 선량 관계와 ELISA가 친화력 측정 방법 적용에 사용될 때 발생할 수 있는 몇 가지 오류를 개괄하며, 일반적인 친화력 측정의 방안과 초보적인 방법학 개발 방안을 소개한다.

2. 친화력의 기본개념

우리는 몇 가지 화학 반응 사례를 분석함으로써 친화력이 무엇인지 설명해 드리겠습니다.

例子A
수소와 산소는 불을 붙이는 조건에서 물을 생성한다.
반응이 멈췄을 때 반응환경에서 수소의 무어농도가 공교롭게도 산소의 무어농도의 2배일 때 량자가 모두 소모되고 반응환경에는 물밖에 없다.수소의 몰 농도가 산소의 몰 농도의 2배보다 크면 산소가 소비돼 반응 환경에는 수소와 물만 있다.과수소의 몰 농도가 산소의 몰 농도의 2배보다 작으면 수소가 소비되고 반응환경에는 산소와 물만 있다.
이것은 화학반응에 관한 기초지식이다. 화학반응이 진행된 결과, 반응물이 생성물로 변할 수 있다. 즉 반응이 끝까지 진행될 수 있다. 이런 반응의 과정과 결과 특성이 있는 반응을 불가역반응이라고 한다.

例子B
PD1 항원(CD279)및 PD1 항체(예: pembrolizumab)상온 상압에서 반응하다.
반응이 멈췄을 때 반응 환경에서 CD279의 무어 농도가 200nM이고 pembrolizumab의 무어 농도가 100nM일 때 이상적인 조건에서 pembrolizumab-CD279 복합체의 농도는 97.86nM이고 CD279의 무어 농도는 4.28nM이며 pembrolizumab은 2.14nM이다.
반응 환경에서 CD279의 무어 농도가 100nM, pembrolizumab의 무어 농도가 200nM일 경우 이상적인 조건에서 pembrolizumab-CD279 복합체의 농도는 49.81nM, CD279의 무어 농도는 0.38nM, pembrolizumab은 159.19nM이다.

예 C
PD1 항원(CD279)및 PDL1 항원(CD274)상온 상압에서 반응하다.
반응 환경에서 CD279의 무어 농도가 200nM, CD274의 무어 농도가 100nM일 경우 반응 완료 시 이상적인 조건에서 CD274-CD279 복합체의 농도는 2.35nM, CD279의 무어 농도는 197.65nM, CD274의 무어 농도는 97.65nM이다.
반응 환경에서 CD279의 무어 농도가 100nM, CD274의 무어 농도가 200nM일 경우 반응 완료 시 이상적인 조건에서 CD274-CD279 복합체의 농도는 2.35nM, CD279의 무어 농도는 97.65nM, CD274의 무어 농도는 197.65nM으로 대부분의 CD279와 CD274는 반응에 참여하지 않았다.
사례 B, C 두 가지 경우, 항원과 항체를 막론하고(배합체 및 수용체)결합 반응, 양자 반응은 복합물을 생성하는 정반응 과정이 있고, 복합물 해리 반응 생성 항원, 항체 역반응 과정도 있으며, 최종 결과는 항원, 항체와 항원-항체 복합물 3자가 공존하는 상태이다.

이런 반응은 이를테면가역반응。
하나의 가역반응에서 정반응과 역반응의 속도가 같을 때 반응체계에서의 항원의 농도, 항체의 농도와 항원-항체복합체의 농도는 더는 증가하지도 감소하지도 않고 가역반응이 완성되며 반응체계에서의 각 성분의 무어농도는 동태적균형에 처해있다.

친화력(애피니티)가역반응 과정 중 항원, 항체와 항원-항체 복합체 사이의 상대적 상태의 특징적인 매개 변수이며, 더욱 전문적이고 용어화된 명칭은 해리 균형 상수 KD, 단위 mol/L(농도 단위와 일치)。

친화력 수치가 작을수록 친화력이 강해지는데, 친화력의 강약은 최종 결정 반응이 완료될 때 역반응할 수 있는 각 조분이 상대적으로 얼마나 되는지를 결정한다.

예를 들어 B와 C는 200nM CD279와 동일합니다.(PD1)반응, 항체 pembrolizumab(PD1 항체)CD279 대비 친화력 0.4nM, 배체 CD274(PDL1)CD279에 비해 친화력은 8200nM이고 종반응으로 생성된 pembrolizumab-CD279 복합체는 97.86nM이지만 CD274-CD279 복합체는 2.35nM에 불과해 42배 차이가 난다.

불가역반응과는 달리 항원 항체의 무어 농도 외에 항원과 항체(배합체 및 수용체)양자 간의 친화력은 *의 영향을 가역반응 중 생성물의 양에 미칠 것이다.

3. ELISA가 방법학 개발을 할 때의 기본 원칙을 아십니까?

친화력 측정 방법과 원리에 대한 개술은 독자가 생물기능학 선별평가 기술의 친화력 평가편을 참고할 수 있다.
본문은 주로 포화농도법을 개괄한다.
R대표수용체또는항원，L대표배체또는항체。
포화농도법을 적용해 수용체 대비 배합체의 친화력을 측정하려면 소량의 R이 존재하는 경우 L을 그라데이션 희석해 R-L 복합체의 농도를 측정하고, R-L 복합체의 농도가 전체 R 농도의 절반을 차지할 경우 L에 해당하는 농도 값을 측정한다.(EC50)R에 대한 L의 KD 값입니다.
RL 복합체/R 즉 B 값은 감지된 신호 값으로 대체할 수 있으며, 그라데이션으로 희석된 L과 신호 사이의 함수 관계는 다음 공식을 만족하며, 이 EC50 값만이 특정 실험 조건에서 KD 값과 동등할 수 있다.
포화농도법은 KD 값을 측정하는 데 몇 가지 관건이 있는데,즉 상호 작용하는 두 분자, R은 소량, L은 연속적인 그라데이션 희석을 진행하기 위해 필요한 신호 응답 값(모든 R의 결합 위치는 L이 차지한다.)즉 플랫폼기, 그렇다면 이 조건에서 R의 절반을 차지할 때 필요한 L 농도(EC50)KD 값입니다.
포화농도법은 주로 RL 복합체를 나타내는 신호값을 측정하는데 측정방법은 류식세포술, 동위원소표기술, 형광편광일 수도 있고 ELISA일 수도 있다.

4. 친화력 측정에 사용되는 ELISA 방법학 개발 상용 방법

레이아웃

일반 운영 프로세스

01효소 표지판의 제조: 취농도 100ug/ml 항원, 실온 용해, 혼합용 가방 피액은 아래 절차에 따라 0.2ug/ml, 0.5ug/ml, 1ug/ml로 희석하고, 샘플링 배치표에 따라 100ul/구멍을 첨가하고, 각각 효소 표지판에 첨가한다(참고 1), 그 중 포피액을 첨가하여 포피항체의 대조를 하고, 2-8 ℃ 로 밤을 지낸다;
02세척액으로 판자를 세 번 씻고, 두드려 말리고, 300ul/구멍 폐쇄액을 넣다(참고 2)실온은 1시간 폐쇄한다.세척액 세척판 3회 건조 대기;
03레이아웃에 따라 항체를 100000ng/ml부터 3배 경도로 희석한다(노트 3), 레이아웃에 따라 100ul/구멍을 마이크로 보드에 추가합니다.
04넣다오호스 마이크로보드 발진기 (ISLDMPHDG)내, 37 ℃, 600rpm 진동 1시간 설치;

05세척액으로 판자를 3회 씻어 말린다.
06효소 결합 항체가 적당한 농도로 희석되다(노트 4), 에서오호스 터빈(VXMNFS)상혼합, 100ul/구멍;

07마이크로보드 발진기에 넣어 37 ℃, 600rpm 진동을 1시간 설치한다.
08세척액으로 판자를 4회 씻어 말린다.
09효소연항체에 대응하는 발색액을 취하고 림용전 20분간 실온으로 균형을 잡고 소용돌이혼합기에 고루 섞는다.
108개의 소총을 사용하여 100ul/구멍에 발색액을 넣기;
11발색액 실온 피광 배치 10-30분(노트 5)；
128개의 소총을 사용하여 100 ul/구멍에 종지액을 넣어 반응을 종료한다(베이스에 따라 이 단계는 필요하지 않을 수 있습니다.)；
13효소 측정기로 신호값을 측정하다.(노트 6)；
14결과 분석(노트 7)。

친근한 작은 NOTE

참고 1:반응 과정에서 고농도의 항체를 줄여야 한다면(100000ng/ml)효소 표판재에 대한 비특이 흡착은 이불을 싸는 과정에서 소수성 효소 표판재를 선택하는 것이 좋다(폴리스티렌), 가방피의 항원 농도는 소량의 0.2-1ug/ml가 필요하며, 구체적인 상황은 항원 항체의 친화력 크기에 따라 판단하고 최적화해야 한다.일반적으로 친화력이 강할수록 필요한 항원 가방의 농도가 낮아진다.
노트2:폐쇄액이 반드시 폐쇄 효과를 낼 수 있는 것은 아니므로, 실험 검증이 필요하다(패킷이 없는 항원 그룹)일반적으로 분자량이 적은 폐쇄제일수록 효과가 좋다.
노트3:방법학 개발 초기에 표준 곡선의 농도 범위 100000ng/ml-0.1ng/ml를 확대하여 뚜렷한 상하 플랫폼기의 전체 곡선을 얻을 수 있으며, 항원 항체 간의 친화력이 비교적 강할 때 경도 농도는 축소할 수 있으며, 희석의 배수는 방법학 최적화 과정에서 2배로 축소할 수 있다.
노트4:효소연합항체효과가 과다하고 효소연합항체의 희석은 부동한 희석도를 비교선택해야 한다. 단항성분의 효소연합항체에 대해 만약 높낮이 두 희석도의 효소연합항체가 같은 선량곡선을 산생할수 있다면 효소연합항체가 과다하고 ELISA의 신호전달에 편차가 생기지 않았음을 말해준다.
다항성분의 효소연합항체에 대해서는 그 희석도의 판단이 비교적 복잡하여 효소연합항체의 무어농도가 포피상의 항원무어농도보다 5배 이상 높다고 초략적으로 계산할수 있다.효소연합항체의 농도가 시간에 비해 높을 때 효소연합항체는 고선량의 부동한 농도의 항체조건에서 모두 잡혔으며 곡선은 가짜플랫폼이 있었다.
노트5:흡광도 값 바탕과 형광 바탕의 경우 기기가 측정하는 신호 값과 발색 시간은 정비례하여 10-30분으로 제어하는 것이 좋다.검측기기의 신호선형범위를 미리 확인해야 한다. 례를 들면 일반적인 효소표시기의 흡광도값의 신호선형범위는 0-3이고 흡광도값은 3-4사이가 비선형이며 발색할 때 신호값이 3을 초과하지 않도록 통제해야 한다. 신호값이 선형범위를 초과할 때 곡선은 가짜플랫폼이 있다.
노트6:서로 다른 바탕물은 서로 다른 기구로 검측해야 한다. 흡광도 읽기, 형광 읽기, 화학 발광 읽기.바탕물 선택 과정에서 실험실의 효소 표시기가 이 유형의 판독 기능을 갖추고 있는지 주의해야 한다.
노트7:표준 제량 곡선 의합 은 일반적으로 4 개 파라미터 로 의합 하기 때문에 뚜렷한 상하 플랫폼 기간 이 필요하다(A, D 값), 기울기는 일반적으로 0.8-1.2(B 값)사이,EC50（C 값)항원에 대한 항체의 친화력 값이다.

5. 총화

포화농도법에 따르면 ELISA로 친화력 측정을 할 때는 항체 농도에 따라 점진적으로 변화하는 신호 곡선이 필요한 명백한 4개 파라미터 S형 곡선이 필요하다.
항체 저농도와 고농도 시 뚜렷한 상하 플랫폼기, 상평기 신호치의 절반에 대응하는 항체 농도(EC50)값은 항원 항체 간 친화력 KD 값입니다.
기기의 검측 신호의 선형 범위가 제한되어 있기 때문에, 신호가 선형 범위를 초과할 때 곡선이 가짜 플랫폼기에 들어가게 되어 측정된 친화력이 정확하지 않다.
패킷의 항원 농도는 신호의 신호 값을 직접 결정합니다.따라서 ELISA로 친화력 측정을 할 때 가방 이불의 항원 농도는 가능한 한 작아 적절한 신호값을 얻도록 한다.효소연항체 농도가 너무 낮을 때도 곡선을 가짜 플랫폼기에 진입시킬 수 있다.

ELISA 방법학 개발 과정에서 효소 결합 항체가 신호의 선형으로 과다하게 전달되려면 실험 검증을 거쳐야 한다.
신호가 효과적인 플랫폼기를 얻을 수 없을 때, 항원 항체 간의 친화력이 너무 약하거나 패킷 피항원이 너무 많기 때문에 더 큰 농도의 항체가 있어야 모든 항원이 플랫폼기에 도달할 수 있다는 것을 설명한다.
ELISA 감도의 제한으로 인해 일부 친화력은 약함(>100nM)의 항체 항원 중 ELISA 방법을 사용하면 기본적으로 효과적인 플랫폼 기간을 얻을 수 없고 측정할 수 없는 친화력 수치도 얻을 수 없다.
ELISA가 친화력 측정을 통해 항원의 활성을 평가하거나 항체의 활성을 측정할 때 얻는 EC50은 작을수록 좋은 것이 아니며, 신호는 가짜 플랫폼기에 들어간다(기기의 검측 한계에 도달하고 효소 결합 농도가 비교적 작다)모두 EC50을 작게 만들어 잘못된 친화력 데이터를 얻게 되는데, 이는 ELISA가 친화력 측정을 할 때 쉽게 발생하는 오류이기도 하다.
오늘날 많은 항원 단백질 공급업체의 항원 활성에 대한 평가에는 이런 오류가 존재한다.

항원과 항체 간의 친화력은 양자의 구조와 상호작용에 의해 결정된다.0.1 nM, 1 nM 또는 1000 nM이 될 수 있습니다. ELISA 친화력 측정 방법의 좋고 나쁨을 평가하려면 이 EC50 값이 친화력의 값과 일치하는지 봐야 합니다. 친화력의 값은 열역학 측정 방법, 동력학 측정 방법과 포화농도법의 세포 흐름 측정법 등 다방면으로 검증할 수 있습니다.
반대로 ELISA 방법이 존재하지 않을 때 신호가 가짜 플랫폼에 들어가는 것과 같은(기기의 검측 한계에 도달하고 효소 결합 농도가 비교적 작다)오류를 기다릴 때 EC50 값은 친화력의 수치를 진실하게 반응할 수 있다.

ELISA를 이용한 방법학 개발은 응용 목적을 명확히 하고 대분자 정량과 친화력 측정이 필요하다.
응용목적에 따라 항원과 항체의 상대선량농도는 아주 큰 차이가 있으며 부동한 선량곡선이 있다.독자들은 전편'ELISA 방법학 개발 실천판-생물대분자 검출의 정량적 방법 개발'과 결합해 비교 연구를 통해 차이를 명확히 할 수 있다.

이번 공유는 여기까지입니다. 우리 다음에 또 만나요!

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