개학 시즌이 또 왔다.실험왕'벽돌 나르기'를 또 하러 간다
어떻게우수우아한 벽돌 나르기또도움을 청할 필요가 없다선배, 선배

그럼요관심"소올림픽 수업"항목그래

오늘 오군이 여러분께 소개해 드릴 건데요.
한 편이다건더기가 가득하다의
서균체 전시 방법 실천 매뉴얼
"서균체의 증폭과 정량"

이것은 모처럼 공부를 잘하는 사람의 필기이다
잘 받으세요 (소장)!

부분 1

교잡종、단세포 복제화서균체 전시 기술항체 발견의 세 가지 주류 기술인데, 그 중서균체 전시 기술으로수상 수준의 기술생물 혁신 의약 연구 개발 과정에서 매우 중요한 역할을 한다.* 는 항체류 약물 개발의 진행을 가속화시켰다.서균체 전시 기술새로운 항체와 폴리펩타이드의 발견 및 최적화 과정에서 핵심적인 역할을 할 뿐만 아니라 전통적인 동물 면역 기술과 결합하여 나노 항체, 전인원 유전자 변형 생쥐 발견 플랫폼과 효과적으로 도킹할 수 있다.항체, 항체 우연성 약물 및 CAR-T/TCR-T 등의 분야에서 널리 사용될 수 있음。본고는 박테리아 전시 기술의 박테리아 증식과 증폭 실험 세부 사항에 대해 연구하고 구체적인 실험 과정의 경험을 공유하며 그 원리를 근본으로 실험 과정을 지도하고 더욱 정교한 실험 과정으로 박테리아 전시 기술이 항체 발견 과정에서 성공률을 높일 것이다.

부분 2

-- 박테리아 라이브러리
확장 및 전시의 기본 원리

현재 보편적으로 응용되고 있는 박테리아체는 항체 조각을 보여주는 체계를"3 + 3 시스템"(3은 박균체의 p3 껍질 단백질)；3+3p3 껍질 단백질의 두 가지 출처를 나타냅니다.

• 박테리아 입자(phagemid)
• 13KO7 보조 박테리아(Helper Phage)

균립(phagemid)의 p3 단백질은 항체 조각의 유전자를 융합하여 문고 다양성의 관건이다;보조 서균체(Helper Phage)의 p3 단백질은 박테리아의 천연 p3 단백질입니다.
* 박균립자는 비교적 작은 입자담체로서 대장균감수상태에서 비교적 높은 전환효률을 갖고있을뿐만아니라 대장균에서도 확대할수 있다.

박테리아 입자가 포함된 대장균은 보조 박테리아(Helper Phage)에 감염되면 대장균의 효소 계통, 원료, 에너지를 이용해 증폭되며, 결국 박테리아 입자가 포함된 박테리아가 대장균에서 방출되며, 이 자대 박테리아의 p3 껍질 단백질은 항체 조각을 보여준다.

부분 3

-- 박테리오균체 증폭 과정에서
당면 과제 및 솔루션

박테리아의 창고 구축 과정은 실제로 항체 조각 유전자 다양성의 전달 과정입니다.
혈액 샘플에서 항체 유전자의 다양성에서 서균 입자로 전달되는 과정은 서균 입자 문고가 구축한 내용이다.
박테리아 입자의 다양성에서 박테리아 입자가 함유된 대장균의 다양성으로 전달되는 것은 박테리아 입자가 대장균으로 전기적으로 전환되는 내용이다.
박테리아 입자를 함유한 대장균의 다양성에서 박테리아로 전달되는 다양성은 박테리아가 증폭되는 내용이자 본고의 실험 경험이 주목하는 문제이다.

서균체의 증폭은 결국 서균 입자 중 단일 복제된 항체 조각 유전자를 서균체의 증폭 과정을 통해 10-100개의 복제본으로 만드는 것이 목적이다.그리고 이러한 복제 유전자는 박테리아 표면의 p3 단백질에 항체 단백질 조각을 보여줄 수 있다.

서균체의 증폭 과정에서 문고의 다양성이 유지되고 전달되려면 문고의 초기 크기에 따라 증폭 과정에서 서균이 함유된 대장균의 수와 부피, 이에 대응하는 보조 서균체의 수를 정하여 효과적으로 감염시키고, 증폭 후 서균이 함유된 서균체를 얼마나 첨가하여 선별하는지 등 일일이 계산하고 평가해야 할 문제들이 있다.서로 다른 문고 크기의 박테리아 라이브러리는 증폭 과정에서 필요한 증폭 부피가 다르다.고착화된 실험 방안은 문고의 다양성을 잃어버릴 가능성이 높다.
이러한 문제를 파악하려면 먼저 다음과 같은 몇 가지 기초적인 선행 지식을 갖추어야 한다.

（👇다음 내용 모두 요점!!!）

1. TG1 대장균의 OD600에서의 판독수: 1OD는 1e9개/ml의 균농도를 나타낸다.
2. 박테리아/보조 박테리아는 TG1이 대수생*에 있을 때 비교적 좋은 감염 효율을 가지고 있으며, TG1이 대수생*에 있는 OD600 값은 0.4-0.8이다.
3. TG1은 수생*에 대한 성장속도가 20분세대이므로 TG1의 생장에 주의를 돌리고 제때에 균을 취하여 실험을 진행해야 한다.4. 보조 박테리아와 TG1의 비율 MOI는 20: 1에서 모든 TG1이 감염되는 것을 보장합니다.
5. 박테리아 입자가 함유된 박테리아는 정상적인 TG1 대장균에 감염될 수 있으며, 박테리아 입자를 TG1에 남겨두고 TG1의 확산에 따라 증폭되며, 보조 박테리아 없이 박테리아 입자가 증폭되지 않는다.
6.서균 입자는 * 저항성을 함유하고 있으며, 보조 서균체는 * 저항성을 함유하고 있다.
7. 박테리아 입자가 함유된 박테리아체는 정상적인 TG1에 감염되어 사다리꼴로 희석하여 * 저항성을 칠한 진지판을 통해 적도 측정을 할 수 있다.8.3 + 3 모드에서 박테리아 입자가 함유된 박테리아는 p3 융합 항체 세그먼트 단백질의 효율이 5~10% 로 비교적 낮음을 보여주며, 채선을 진행할 때 첨가된 박테리아의 적도는 문고 다양성의 100배 이상이어야 한다.
그리고 또 하나 중요한 게 있어요.박테리오균체는 바이러스로서 에어로졸 형태로 공기 중에 퍼져 실험실의 환경을 오염시켜 F인자 양성의 대장균에 감염되기 쉽다."생물왕을 좀 아까워하고, 생명의 위험을 무릅쓰고 벽돌을 옮기자!"
에서서균체 전시에 관한 실험상대적으로 폐쇄된 실험실에서 진행해야 한다대장균에 대한 서균체의 오염을 피하기 위해특히 정상적인 TG1 대장균을 배양할 때서균체의 불활성화 방식은 보통 자외선을 30분 이상 비춘다.
(합격한 생물왕은 감정을 얻지 못하는 바이러스 킬러이다!)

부분 4

- 박테리아 확장증화정량
구체적인 실험 과정의 공유

다음은 하나의 문고 크기가 1E9인 박테리아 문고를 증폭하는 실험 방안이다.
* 문고가 너무 크거나 작으면 비례에 따라 부피를 증감하고 늘릴 수 있다.

1일
대머리 벽돌을 나르는 날

1. 박테리아 입자가 함유된 TG1 균종 1ml(균수 1E10)를 취하여 100ml 함유 2xYT-GA 배양기 250ml 요병에 넣고,사용오호스 요상37도 220rpm 요균 요상에서 OD600까지는 약 0.5。2. OD600이 약 0.5인 균액 20ml(균수 1E10)를 채취해 MOI가 20:1이면 pfu가 2E11인 보조 박테리오인 M13 K07, 37도 220rpm을 30분 동안 진동시켜 감염시킨다.3. 감염 후 균액 을 채취하여 50ml 의 원심관 에 사용 하다오호스 원심분리기 5816R3200g 원심분리 10분, 배지를 제거하여 배지의 포도당을 제거하여 박테리아 입자의 p3 단백질에 항체 세그먼트 단백질의 발현을 억제한다.4. 2xYT-AK 배지 중현균단으로 배지를 400ml까지 더하고 1L 요병으로 30도 220rpm에서 밤새 요균한다.

날 2
대머리 벽돌을 옮긴 다음 날

5.400ml의 균액을 큰 원심병에 균등하게 나누고,사용오호스 원심분리기 5816R 10000g 원심분리 10분, 청을 취하고 10000g 다시 10 분,남아 있는 균체 조각을 제거하다.6. PEG 용액 90ml를 취하여 상청액 400ml에 첨가하여 4 ℃ 에서 1시간 동안 부화시키고 부드러운 진동을 동반한 다음저온 제어 기능이 있는오호스 원심분리기 5816R 4℃ 10000g 원심분리 1시간。7. 상청을 제거하고 10mlPBS로 균체를 다시 현탁한 후 2.5ml의 PEG 용액을 첨가하여 다시 침전한다.8. 얼음 위에서 20분 동안 부화시킨 다음저온 제어 기능이 있는오호스 원심분리기 5816R4℃ 10000g 원심분리 30분。9. 상청액을 제거하고 흡수지로 남아 있는 PEG 용액을 빨아들여 PBS 중현식균체를 1-2ml 첨가하여 적도 측정을 한다.

적도 측정:
1. 분리된 실험실에서 정상적인 TG1 대장균을 취하여 2xYT의 배지에 첨가하고,사용오호스 요상OD600까지 흔들기 0.5만약 제때에 사용하지 못할 경우 4 ℃ 를 2시간 동안 넣어 예비할수 있다.
2.9단계에서 박테리아 원액 증폭을 PBS로 1E5-1E7배 희석한다.
3. 10ul 서균체 희석액을 취하여 490ul OD600이 0.5인 TG1 대장균에 첨가하고,사용오호스 요상 37℃ 220rpm 30분 진동감염을 일으키다.
4. 감염액 50ul을 취하여 2xYT-GA가 함유된 진지판에 골고루 바르고 말린 후 37 ℃ 배양함에 넣어 밤을 지낸다.TG1에 감염되지 않은 대장균을 진지판에 발라 음성 대조를 한다.

날 3
대머리를 옮긴 지 사흘째 되는 날

5. 2xYT-GA의 경지판에서의 클론 수를 세고, 희석 배수에 따라 박테리아체를 증폭시키는 적도를 계산한다
박테리아 적도(pfu/ml)=(클론수*10*50/10ul)*희석배수
6.1E11-1E12의 서균체를 채취하여 채취에 사용한다.

시약 처방:
2xYT 배양기:효모 추출물 10.0 g/L+트립톤 16.0 g/L+NaCl 5.0 g/L
2xYT-GA 배양기:2xYT 배양기 +100 μg/ml *+ 1% (W/V) 포도당
2xYT-AK 배양기:2xYT 배양기 +100μg/ml *+50μg/ml*
PEG溶液：20% (w/v) PEG 6000의 2.5 M NaCl

부분 5
기기 *:

(과학연구민공으로 일하는 하루하루는 외롭지 않다. 왜냐하면 오모가 동반하기때문이다.)

박테리오균체는 바이러스로서 에어로졸의 형식으로 공기중에 쉽게 확산되여 실험실의 환경을 오염시킬수 있으며 페쇄된 실험실이 필요하며 실험실의 모든 기구는 단독으로 사용해야 한다.
오호스항온 경부하 배양 로터회전 속도 범위는 100-12-rpm이며 볼륨 집약적이며 견본에 뛰어난 흔들림 효과를 제공합니다.

또한 박테리아가 실험을 보여주는 과정에서 부동한 부피, 부동한 회전속도와 4 ℃ 의 조건이 필요한 원심분리절차가 있게 되는데 만약로다
원심분리기실험의 수요를 만족시키다실험 설비 자산의 공백을 초래하여 *의 낭비를 초래할 수 있습니다!！！

오호스5816R 다기능 원심분리기및 선택 가능한 로터는 박테리아 관련 실험에 편의를 제공하며, 원심분리기 한 대가 모든 실험 수요를 만족시킨다!

다음은 샤오오가 태워줄게
"과학 연구 경비를 절약해 드릴게요" 이 차
오호스의 양털을 제대로 뽑으라고

독일*
강력한 원심분리형
오호스 Frontier™원심분리기 가족
출시"1 더하기 1".* 활동

* 모델은 다음과 같습니다.
미량 고속 원심분리기FC5515R는(냉동 모델)
미량 고속 원심분리기FC5515는(비냉동 모델)
새로운 컴팩트형 마이크로 원심분리기FC5513은
지금 타면 아직 늦지 않았어!

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